以shotgun技術為代表的液相色譜技術路線在對未知蛋白質(zhì)的大規(guī)模鑒定尤其是低豐度蛋白質(zhì)鑒定方面有很強的優(yōu)勢,但是這種基于肽段分離的技術在分析中忽略了很多完整蛋白質(zhì)的信息(包括翻譯后修飾方面的信息)。為了彌補或提高此路線對翻譯后修飾蛋白質(zhì)的檢測能力,Yates與其合作者們采用了一些蛋白質(zhì)酶解的新方法,即采用多種不同的酶對蛋白質(zhì)進行酶解從而產(chǎn)生重疊的肽段。
例如,胰蛋白酶對蛋白質(zhì)進行特定位點的酶解,而其他兩種酶進行非特異性的酶解;然后利用酶解產(chǎn)生的重疊肽段統(tǒng)計分析完整蛋白質(zhì)的信息。但這種方法應用起來非常繁瑣復雜。相比之下,雙向凝膠電泳為代表的“top-down”
技術路線在保留完整蛋白質(zhì)信息方面有著特有的優(yōu)勢。如何讓液相色譜技術實現(xiàn)“top-down”的路線,即用液相色譜技術實現(xiàn)對完整蛋白質(zhì)的直接分離分析,讓它既保持其固有的測定蛋白質(zhì)物理化學性質(zhì)的優(yōu)勢,又能夠兼具“bottom-up”技術對未知蛋白質(zhì)的鑒定尤其是規(guī)模鑒定的優(yōu)勢,是色譜工作者的新課題,也是蛋白質(zhì)組學研究技術領域的又一大挑戰(zhàn)。針對這個問題國內(nèi)外的一些實驗室進行了探索,典型的是采用離線的方式,即利用多維液相色譜技術直接分離完整蛋白質(zhì)。
較早采用的是以制備級等電聚焦電泳作為第一維,以反相液相色譜為第二維的聯(lián)用系統(tǒng)實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的分離。Lubman及其合作者使用Rotofor液相等電聚焦電泳儀對細胞裂解液中的蛋白質(zhì)一次性進行等電聚焦,然后以rplc作為第二維進行分離。該方法在自動化和通量方面比雙向凝膠電泳技術有著明顯的優(yōu)勢。VerBerkmoes及其合作者運用陰離子交換色譜作為第一維色譜對酵母細胞的蛋白樣品進行分離,所得每一個餾分都被分為兩份,一份酶解后由質(zhì)譜鑒定,另一份利用電噴霧傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜進行相對分子質(zhì)量的測定,兩組結(jié)果對照起來對目標蛋白質(zhì)進行分析,在完成對未知蛋白質(zhì)鑒定的同時得到了蛋白質(zhì)的分子量等信息。
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